产品目录

本试剂盒是专为RNA样本的LAMP扩增反应设计，制品中Bst4.0+ DNA Polymerase中包含Bst 2.0 DNA聚合酶、极其耐热的反转录酶、RNase Inhibitor，在RNA的LAMP扩增中无需再加入任何其它酶制品即可用于RNA的LAMP扩增。除此外，Bst4.0+ DNA Polymerase中不含有甘油成分，因此可用于建立LAMP引物mix与酶制品的冻干品，以提高LAMP检测制品的稳定性和易用性。本试剂盒可用于浊度分析、浊度仪或搭配OTG橙绿变色反应管显色。

2.5μL Bst4.0+ Polymerase包含8U Bst2.0 DNA聚合酶、20U耐热反转录酶、8U RNase抑制剂、22%海藻糖。本制品不含甘油，可用于冻干。

• 对成功建立LAMP检测方法至关重要的四个参数分别是：引物位置、引物使用浓度、反应温度(60～65℃)和反应时间。引物使用浓度、反应温度是优先要确认的参数，如经过参数调整后仍不能达到检测用标准，则重新设计引物组合，再进行测试。
  
• 在用于其它恒温扩增反应时（如CPA、SMAP等），可参考如上策略进行使用，反应时间可能会需要调整。
  
• 关于矿物油的使用，在配制完LAMP反应体系后，可加入一滴矿物油覆盖于反应液上部，以减少气溶胶的污染。

• 配制RT-LAMP反应体系
  
  • 在0.2mL EP反应管中加入下述试剂
    

    成分	用量
    2×IsoAmp Buffer	10μL
    Bst4.0+ DNA Polymerase	2.5μL
    10×LAMP Primer Mix	2μL
    模板RNA	X μL
    ddH2O	至20μL

    • 10×LAMP Primer Mix浓度：FIP/BIP分别为16μM、LoopF/B分别为4μM、F3/B3分别为2μM。
  • 全部试剂加入完毕后，轻弹EP管底部后，再盖上OTG橙绿变色管。
    
    • 盖上管盖后务必不要剧烈混合与倒置，防止将管盖上的OTG染料溶解，OTG染料一旦混入反应液将会终止LAMP反应。
      
    • 首次实验时Primer Mix分别采用1、1.5、2μL，以阴性不变色，阳性样品正常变色为准，作为后续测试用量。
• 反应体系配好后，置于60～68℃（首次实验采用65℃）进行反应20～45min。
  
  • 扩增良好的引物组合，通常25min即可变色，一般不超过45min，首次实验设置20、25、30、45min。
• 观察结果：观察结果时，尽可能不要与配制反应空间共用，以防止污染操作台。将反应EP管倒置，并手腕轻甩，反应液浸泡EP管盖上的OTG染料，静置30s。再将EP反应管正置，并轻甩反应液到EP管底部，此时扩增样品将变为鲜艳肉眼可见绿色，而阴性未发生扩增的管将为深橙色。

• 在0.2mL EP反应管中加入下述试剂配制RT-LAMP反应体系
  

  成分	用量
  2×IsoAmp Buffer	10μL
  Bst4.0+ DNA Polymerase	2.5μL
  10×LAMP Primer Mix	2μL
  模板RNA	X μL
  ddH2O	至20μL

  • 10×LAMP Primer Mix浓度：FIP/BIP分别为16μM、LoopF/B分别为4μM、F3/B3分别为2μM。
• 反应体系配好后，充分混匀并短暂离心，置于60～68℃进行反应，连接LAMP实时浊度仪，对浊度变化进行实时检测。也可肉眼分别于30min、45min、60min观察浊度变化。必要情况下85℃热失活5min（可选）。

• 搭配OTG橙绿变色反应管（肉眼观察）
  
  图1.以Sars-CoV-2体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、10⁴和10⁶Copy，NTC为ddH2O为模板，65℃反应20min后
• 用于浊度检测（肉眼观察或采用浊度仪）
  
  图2.以Sars-CoV-2体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、10⁴和10⁶ Copy，NTC为ddH2O为模板。上图为加样结束反应起始前，下图为65℃反应30min后。

• 引物及酶制品的冻干（可参考）
  

  成分	用量
  Bst4.0+ DNA Polymerase	2.5μL
  10×LAMP Primer	2μL
  45%海藻糖	0.5μL
  总体积	5μL

  将该制品进行冻干处理，获得冻干品。
  
• 冻干制品的LAMP扩增
  向一份冻干品中加入10μL的2×IsoAmp Buffer溶解冻干制品，并加入最多10μL的检测RNA模板，总体积为20μL。进行LAMP扩增。